Hoefer TE22 - Manuale (Pagina 26)

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Trasferimenti di acido nucleico
Gli acidi nucleici devono di norma essere trasfe-
riti in forma denaturata per l’associazione più
efficiente. RNA è normalmente denaturato con
gliossale prima della separazione o separati
in denaturazione gel contenenti formaldeide
o mercurio metile. Tuttavia, DNA a doppio
filamento è denaturata solitamente in gel con
NaOH. L’alcali deve essere neutralizzata e il gel
equilibrata in tampone di trasferimento prima
electrotransfer. Sia per DNA e RNA gel, ogni
SDS deve anche essere rimosso per assicurare
vincolante efficiente. Bittner et al. (1980) wash
gel tre volte, 20 minuti ciascuna, per assicurare la
completa rimozione dei denaturanti e detergenti.
Vedi Bittner et al. per uno studio l’efficienza di
trasferimento di DNA di dimensioni diverse. Il
buffer di trasferimento Bittner contiene 25 mM
sodio fosfato, pH 6,5. Inoltre descritto è un
metodo per l’introduzione di nick per azione
limitato nucleasi per facilitare il trasferimento di
frammenti di DNA più grandi.
Buffer di DNA consigliati includono il tampone
fosfato di sodio Bittner (vedi riferimento) e TBE.
Per RNA, TAE è raccomandato. TBE e TAE
ricette magazzino sono elencati di seguito. Questi
tamponi sono più spesso diluiti a 1X, ma la
concentrazione può variare fino a 0,1X. Il raffred-
damento è fortemente raccomandato per questi
buffer, specialmente alle alte concentrazioni.