Hoefer TE22 - Manuale (Pagina 21)

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Electrotransfer note
Vantaggi trasferimento elettroforetico
Trasferimento elettroforetica di proteine e acidi
nucleici è molto più veloce rispetto ai metodi
blotting prima descritti da Southern per il DNA,
Alwine et al. Per l’RNA, o Renart et al. per
le proteine.
Il metodo di trasferimento serbatoio utilizza
corrente elevata per ridurre il tempo di trasfe-
rimento della maggior parte dei campioni per
45-60 minuti.
Trasferimento elettroforetico può migliorare
l’efficienza di trasferimento elettroforetico su
non-blotting, specialmente per le proteine, ma
non tecnica di trasferimento quantitativa è stata
ancora sviluppata a causa della complessità delle
reazioni. Recupero quantitativo non è effetti-
vamente necessario per la maggior parte degli
scopi perché macromolecole associazione ad una
membrana aumenta la sensibilità dei metodi di
rilevazione come autoradiografia e consente il rile-
vamento di proteine specifiche mediante anticorpi
o etichette affinità, e di specifici acidi nucleici
mediante ibridazione con filamenti complementari
di RNA o DNA.
Il tampone può essere scelto per determinare un
trasferimento o verso il catodo e l’anodo. Il pH
deve essere tale che tutte le specie di interesse sono
cariche e migrano nella stessa direzione. La forza
ionica non dovrebbe essere troppo alto, poiché ciò
provocherebbe una corrente eccessiva e calore. Per
questo motivo, le condizioni di sale utilizzate da
Southern blotting per capillare di DNA non può
essere utilizzato. I sistemi tampone più utilizzati
sono quelli di Towbin et al. per il trasferimento di
proteine, e di Bittner et al. per il trasferimento di
acidi nucleici. Sistemi tampone per il trasferimento
di ogni tipo di campione sono elencati più avanti in
questa sezione.