Hoefer SE400 - Manuale (Pagina 23)

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2.3 Preparazione del campione
La quantità di campione caricato dipende dallo
spessore del gel, la sensibilità del metodo di
rilevamento utilizzato, e la quantità di campione
previsto in ciascuna banda. In un sistema
tampone continuo, il campione deve essere
relativamente concentrato perché non viene
utilizzato gel di impilamento. In un sistema
tampone discontinuo, la zona in cui ciascuna
specie molecolare migra è acuito dal gel di
impilamento, quindi il campione non deve essere
così concentrato.
1
Preparare i pozzetti. Togliere il pettine delicatamente
cullandolo un lato all’altro e poi sollevando verso
l’alto per evitare di danneggiare le pareti del pozzo.
Sciacquare accuratamente ogni pozzetto con tampone
di elettroforesi per rimuovere acrilammide non polim-
erizzato e quindi scaricare invertendo il panino gel
(o caster). Riempire ogni pozzetto con tampone di
elettroforesi.
2
Preparare il campione. Aumentare la densità del
liquido campione con il 10% glicerolo o saccarosio.
Aggiungi un colorante di monitoraggio come il rosso
fenolo, blu di bromofenolo, o pironina Y.
Per gel SDS proteici, 2X tampone di utilizzare un trat-
tamento per denaturare entrambi i campioni secco e
liquido in una provetta:
Per campioni proteici liquidi, aggiungere un volume
uguale di 2X tampone di trattamento.
Per asciugare campioni proteici, aggiungere volumi
uguali di 2X tampone di trattamento e acqua deioniz-
zata per ottenere la concentrazione desiderata.
Riscaldare il tubo in acqua bollente per 90 secondi,
poi lasciare raffreddare a temperatura ambiente.
Campioni trattati possono essere conservati a -40 a
-80 °C per le corse successive.
Proteine di membrana di calore a 60 °C per 20
minuti. Conservare campione inutilizzato a 4 °C.
Tabella 2. Volume di Well (µl)
per 1 mm di profondità per ogni
taglia pettine
spessore pettine
(mm)
Numero
di pozzi 0,75 1,0 1,5
10 6,2 8,3 12,4
12 5,8 7,7 11,5
15 4,3 5,7 8,6
20 3,1 4,1 6,2
28 2,1 2,7 4,1