Hoefer IEF100 - Manuale (Pagina 57)

• p51
Appendice B: Reagenti e soluzioni
Preparazione del campione
I campioni preparati per il 2D dovrebbe essere pienamente denaturati,
priva di materiale insolubile, e in generale bassa forza ionica.
Alcuni campioni di proteine prontamente solubilizzare, mentre altri
sono più difficili, che richiedono reagenti aggiuntivi, quali tiourea,
detergenti speciali, ecc) per favorire la solubilizzazione. Le classi di
additivi comuni sono elencati di seguito.
Denaturanti
L’urea è il reagente più comune utilizzato in IEF per interrompere il
legame interno della proteina, permettendo a svolgersi. I campioni
vengono preparati usando concentrazioni di urea 8–9,5 M. In gene-
rale, maggiore è la concentrazione di urea meglio un campione può
essere solubilizzato. Urea raggiunge il suo punto di saturazione in
prossimità 10 M a temperatura ambiente.
Tiourea viene anche utilizzato per solubilizzare meglio alcuni
campioni. Spesso, 2 M tiourea è combinata con 5–7 M urea come
reagente per la preparazione del campione e reidratazione IPG.
Detersivi
Diversi tipi di detergenti non ionici o zwitterionici possono essere
usati per solubilizzare campioni (CHAPS, Triton X100 e Nonidet
NP-40, e detergenti alkylamidosulfobetaine). CHAPS è il detersivo più
ampiamente usato per elettroforesi 2D. È stabile in soluzione. Deter-
sivi come la SDS non sono compatibili con IEF perché si legano alle
proteine e mascherare carica nativa delle proteine.
Riducenti
Ditiotreitolo (DTT) è comunemente utilizzato per ridurre le proteine
in IEF. DTT rompe in soluzione, quindi vengono normalmente
preparati e aggiunto appena prima dell’uso. Altri riducenti come
2-mercaptoetanolo, Dithioerythritol (DTE) e tributilfosfina (TBP) può
essere utilizzato.
Altro
Anfoliti Carrier o tamponi IPG possono essere aggiunti per facilitare
la solubilità delle proteine e aiutano a prevenire la precipitazione delle
proteine durante la messa. Le concentrazioni di 0,5%–2% (v/v), sono
tipicamente utilizzati. Anfoliti Carrier può interferire con alcuni espe-
rimenti di marcatura. In questi casi, i reagenti devono quindi essere
omesso dalla fase di estrazione del campione.
Classi comuni di additivi
Denaturanti
Aprire le proteine per esporre le cariche
interne nativi.
Detergenti non ionici
Campioni di più solubile senza alterare
la carica proteica.
Riducenti
Guida rompere i legami disolfuro interni
a svilupparsi ulteriormente le proteine ,
e contribuire a ridurre gli effetti negativi
di ossidazione delle proteine durante la
reidratazione e la IEF.
Altro
Amphoytes Carrier, proteasi, DNasi e
RNasi.