Hoefer IEF100 - Manuale (Pagina 58)

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Linee guida generali
• Procedure di preparazione dei campioni sono perfezionata e stan-
dardizzata. Si consiglia di consultare la letteratura per determinare
se un particolare buffer di preparazione del campione è raccoman-
dato per il tipo di campione.
• IEF funziona meglio con i campioni di proteine pure che sono solu-
bilizzati e denaturati, e privo di molecole interferenti.
• Rimuovere il materiale insolubile con centrifugazione.
• Tenere il contenuto di sale più basso possibile.
• Usare reagenti freschi preparati di alta qualità, o soluzioni reagenti
che sono stati conservati congelati.
• Non lasciare soluzioni di urea a temperatura ambiente per lunghi
periodi di tempo.
• Non Riscaldare campioni di proteine nelle soluzioni di urea. Riscal-
damento carbamylation causa di proteine e altererà la carica delle
proteine native.
• Conservare i campioni in ghiaccio per prevenire il degrado.
• Aggiungi inibitori della proteasi per evitare che l’attività della prote-
asi. Gli inibitori della proteasi, quali PMSF Pefabloc o può essere
aggiunto per inibire l’attività di serina proteasi mentre pepstatina
può inibire proteasi aspartiche.
• Alcuni protocolli anfoliti utilizzare supporti di base o tris per otte-
nere un pH elevato nel buffer campione. Questo aiuta a solubi-
lizzare alcune proteine e riduce l’attività enzimatica che attaccano
le proteine .
• DNA e RNA possono spesso essere rimosso mediante ultracentrifu-
gazione. Il campione può anche essere trattata con DNasi RNase e
la soluzione per abbattere gli agenti inquinanti.
• Tieni presente che alcuni inibitori della proteasi, DNase e RNase
sono proteine se stessi e può mostrare su una mappa 2D.
• L’acqua utilizzata per fare i reagenti devono essere della migliore
qualità disponibile. Acqua con una resistività di >5 megaohm-cm è
la cosa migliore. Acqua purificata per osmosi inversa o acqua deio-
nizzata è accettabile.
Nota: I sali sono forse il
contaminante più comune causa dei
risultati IEF poveri.