Hoefer PR625 Immunoblot - Manuale (Pagina 18)

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Appendice B: rilevamento
utilizzando ECL sistemi
occidentali di rilevamento
blotting
Hoefer raccomanda di eseguire l’etichettatura e
la rilevazione sulle macchine seguendo le istruzi-
oni fornite nella etichettatura Western blotting
e kit per il rilevamento. Di seguito è riportato
un protocollo generale in base al GE Healthcare
(già Amersham Biosciences) ECL Kit occidentale
Blotting Detection.
Ci sono diversi sistemi occidentali di rilevazione
ECL blotting disponibili.
Il seguente protocollo generale si consiglia:
1
Dopo l’elettroforesi e trasferimento di proteine
separate su nitrocellulosa o PVDF (basso Hybond
LFP fluorescenti per la massima sensibilità) della
membrana, bloccare i siti aspecifici con una soluzione
adeguata di blocco.
2
Blocco è seguita da due lavaggi in rapidi PBS/0.1%
Tween (PBS-T).
3
Immergere e incubare la membrana con un anticorpo
antigene-specifico primario di concentrazione
ottimizzato.
4
Rimuovere la membrana con due lavaggi rapidi di
PBS-T seguita da 2 lavaggi più lunghi (2 × 5 min
a dondolo).
5
Incubare la membrana con una concentrazione otti-
male di anticorpo secondario coniugato.