Hoefer PR625 Immunoblot - Manuale (Pagina 15)

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Passo 2.
Dopo che i gel sono cancellati, le bande sulla
membrana non sono visibili. Aggiunta di un colorante
reattivo non renderà facile allineare la membrana. Ciò
può essere fatto in due modi:
A. Per carichi proteina più grande (>250 ng) Ponceau
S può essere utilizzato per colorare le proteine revers-
ibilmente sulla membrana successivo trasferimento
elettroforetico.
Sciacquare la membrana brevemente in acqua e
macchia nello 0,2% Ponceau S per 1 o 2 minuti,
quindi Decolorare in diversi cambiamenti di acqua
distillata fino a bande rosse appaiono su uno sfondo
bianco. Poiché la macchia viene perso durante la
successiva fase di bloccaggio, bande proteiche devono
essere marcati in questa fase con fori o con una matita
appuntita. La macchia può anche essere fotocopiata.
Ponceau S macchie colorate possono essere conser-
vati per mesi a 4 °C, mantenuto umido tra fogli di
carta parafilm o buffer saturo filtro. Macchie possono
anche essere congelati in un sacchetto di plastica.
Polvere Ponceau S deve essere sciolto in acqua distil-
lata per ottenere una soluzione di lavoro. La soluzione
può essere riutilizzato per diverse settimane o mesi a
seconda del numero di macchiato membrane.
B. Per carichi proteico inferiore (<250 ng), verde di
metile, pironina Y o viola profondi possono essere
usati per marcare in modo permanente alla parte
superiore e inferiore del gel per successivo allinea-
mento con i canali ImmunoBlot.
Quando si carica il gel, aggiungere circa 5 µl di metile
verde (0,1% soluzione in 50% glicerolo) o pironina Y
(0,05% in soluzione 50% glicerolo) alle corsie desid-
erati. Questi coloranti migrare appena prima del fronte
di colorante blu di bromofenolo in gel, e trasferirà
in modo permanente alla membrana. Una seconda
aliquota del colorante aggiunto al gel vicino alla fine
della corsa elettroforetica entrerà nel gel risolvere in
5 a 10 minuti e servono per segnare l’inizio del gel.
Si prega di tenere presente che questi coloranti fluo-
rescenti possono interferire con i metodi occidentali
di rilevazione blotting e deve quindi essere rimossa
prima di imaging. Se lasciato sulla membrana che si
tradurrà in segnali non specifici in fluorescente rileva-
mento Western blotting.