Hoefer PR625 Immunoblot - Manuale (Pagina 12)

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Appendice A: note tecniche
Nota 1: Blocco della membrana
Le membrane devono sempre essere bloccato
prima di montare in ImmunoBlot. Si prega di
seguire le istruzioni per il blocco, previsto nel kit
di rilevamento occidentale blotting.
Generalmente, 5% di latte non grasso secco o
5% BSA sono usati come agenti bloccanti.
Blocco con detergenti Tween-20 o un altro sole,
non è raccomandato in quanto potrebbe causare
una lenta diffusione laterale delle proteine attra-
verso la membrana di nitrocellulosa. È consi-
gliabile eseguire la fase iniziale di blocco in una
soluzione contenente proteina (per esempio, 5%
BSA) senza detergente. Evitare lavaggi estese con
soluzioni contenenti nessuna proteina prima di
montare la membrana nel ImmunoBlot.
In molti casi, blocco soddisfacenti può essere
ottenuto mediante incubazione con PBS/10%
vitello neonato serum/0.1% Tween-20 per un
minimo di un’ora a temperatura ambiente.
Tuttavia, agenti bloccanti differiscono nella loro
efficacia a seconda delle circostanze. Per blot
di lisati di cellule intere, blocco 50 o il 100%
di siero può essere molto efficace nel ridurre il
legame non specifico.