Hoefer HE33 - Manuale (Pagina 23)

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DNA di rilevamento
Il DNA può essere rilevato mediante la fluorescenza
del bromuro di etidio o legato tramite autoradiografia
di DNA radiomarcato.
Etidio bromuro (0,5 µg/ml) può essere aggiunto al
tampone di corsa per monitorare il progresso cam-
pione perché fluorescenza del colorante sotto una
lampada UV rivela posizione banda. (Per verificare
i progressi, spegnere l’alimentazione e rimuovere il
coperchio dell’unità di agarosio. In possesso di un
portatile lampada UV vicino al vassoio in esecuzio-
ne. Rimettere il coperchio e accendere di nuovo per
riprendere elettroforesi.)
In alternativa, dopo elettroforesi, il gel macchia in una
soluzione di bromuro di etidio (0,5 µg/ml H
2
O) per 15
a 60 minuti e quindi visualizzare o fotografare il cam-
pione su un transilluminatore UV.
Per fotografare il gel, o riporlo in esecuzione sulla
superficie del transilluminatore o far scorrere il gel
sulla superficie per l’esposizione massima. (Il vassoio è
in esecuzione trasparente del 95% a 302-nm leggero
e trasparente, il 40% della luce a 254 nm.) Visualizza
il campione di 366 nm di luce UV o ridotta intensità
di 302-nm di luce UV per ridurre photonicking.
Per ridurre la fluorescenza di fondo di bromuro di
etidio legato, il gel può essere decolorato immergendo
per 5 minuti a 0,01 m MgCl
2
, o per 1 ora in 0,001 M
MgSO
4
. Decolorazione rende più facile rivelare piccole
quantità (inferiori a 10 ng) di DNA. (Sambrook, sezio-
ne 6.15).
Bibliografia
Ausubel, et al., (eds). Current Protocols in Molecular
Biology. Greene Publishing and Wiley-Interscience.
New York (1993).
Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecu-
lar Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Har-
bor Laboratory Press (1989).
Attenzione! Etidio bromuro
è un noto agente mutageno.
Indossare sempre guanti durante
la manipolazione.
Attenzione! Indossare occhiali di
protezione UV e proteggono la
pelle quando si utilizza qualsiasi
fonte di luce UV.
Nota: il bromuro di etidio
rallenta la migrazione del DNA
di circa il 15%.
Nota: minimizzare il tempo
di colorazione per evitare che
piccoli frammenti di acido
nucleico da diffondendo al di
fuori del gel.